ICS65.020.20 CCSB38 SAASS 团 体 标 准 T/SAASS113—2023 丹参组培快繁技术规程 RapidpropagationtechnicalregulationsfortissuecultureofSalviamiltiorrhiza Bunge 2023-06-20发布 2023-06-20实施 山东农学会  发布 全国团体标准信息平台 T/SAASS113—2023 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省中草药产业体系提出。 本文件由山东农学会归口。 本文件起草单位：山东省农业科学院经济作物研究所、济南市农业科学研究院、上海尤合生物科技 有限公司。 本文件主要起草人：李玉梅、王宪昌、高玉民、朱彦威、孔祥锋、张教洪、秦培文、毛伟芳、赵文 利、张文杰、王国强、韩金龙、田北京、王志芬、马强。 全国团体标准信息平台 T/SAASS113—2023 1丹参组培快繁技术规程 1范围 本文件规定了丹参组织培养的实验室设施设备、培养基制备、组织培养和苗期管理等技术要求。 本文件适用于山东省道地药材丹参优良品种的繁育及推广应用。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T8321（所有部分）农药合理使用准则 NY/T2306-2013花卉种苗组培快繁技术规程 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 丹参SalviamiltiorrhizaBunge 唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物。 3.2 外植体Explant 本试验用做组织培养试验材料外植体为品性优良的丹参植株的茎尖幼嫩叶片。 4实验室设施设备与要求 4.1实验室设计与设施 实验室设计与设施按照NY/T2306-20134.1.3执行。 4.2实验仪器设备 蒸馏水机，纯净水机，冰箱，培养基罐装机，臭氧发生器，空调，紫外灯，超净工作台，高压灭菌 锅，电子天平，微波炉，煮锅，专用剪子、镊子等实验设备。 5培养基的制备 5.1培养基 原料为固体粉末脱水MS标准培养基。 5.2植物生长调节剂母液的配制 5.2.1配制浓度和方法 配制浓度：6-BA1.0 mg/L，NAA1.0 mg/L，2.4-D0.1 mg/L。 配制方法：样品称取后溶解。NAA、IBA、IAA等常用少量的95 %乙醇或0.1 mol/LNaOH溶解，再加蒸 馏水定容。6-BA、KT先用少量1 mol/L盐酸溶解，再加蒸馏水定容。所用水要符合GB/T6682的要求。 5.2.2贮藏 全国团体标准信息平台 T/SAASS113—2023 2植物生长调节剂配制完成后分别贴上标签（配制浓度、日期、配制人等），贮存于2 ℃～4 ℃的冰 箱中，贮藏时间控制在90 d内。如有霉菌和沉淀产生，需重新配置。 5.3培养基的制作 5.3.1培养基配制 根据培养基配方，称取MS培养基，加入适量纯净水，用玻璃棒搅拌至完全溶解，备用。同时把配制 培养基所需要的纯净水煮沸，将溶解好的MS溶液倒入已烧开的纯净水中，用玻璃棒搅拌，沸腾状态下继 续搅拌5 min，至琼脂完全溶解。 5.3.2加入激素 根据不同培养基配方，准确量取所需激素，倒入培养基充分搅拌均匀。 5.3.3pH值调节 定容后调节pH值。用0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液，将pH值调节为5.8～6.5。 5.3.4分装 将配制好的培养基趁热分装到培养瓶，愈伤培养基分装40 mL/瓶；生芽增殖培养基60 mL/瓶，生根 培养基分装40 mL/瓶。 操作时，尽量避免将培养基粘到瓶口和瓶壁，否则容易引起污染。将已分装的培养基封口并注明配 制日期和培养基种类后进行高压灭菌。 5.3.5封口 培养瓶用封口膜或瓶盖封口，用绳子扎紧或拧紧。 5.3.6灭菌 将配制完成的培养基立即进行灭菌，灭菌温度125 ℃，灭菌时间25 min，待高压灭菌锅温度低于 100 ℃，压力表指针归0时，及时把培养基拾出，冷却。同时灭菌无菌瓶和无菌水，接种时备用。 5.3.7储存 灭菌后的培养基标明种类、编号及日期，冷却和凝固后放置观察2 d～3 d，按灭菌先后顺序使用， 且存储时间不超出30 d。 5.4环境灭菌 对环境进行定期灭菌。采用二步灭菌法：一是用臭氧发生器空气灭菌，1次/d，2 h/次；二是用75 % 乙醇或84消毒液进行喷洒。对无菌操作室（接种室）、培养室和准备室采用紫外灯灭菌。接种所用的超 净工作台在空气过滤灭菌的基础上再配合使用紫外灯照射灭菌20 min～30 min，再用75 %乙醇对超净工 作台表面进行擦拭。 5.5接种工具灭菌 接种用的工具、无菌水等必须在灭菌锅内压力0.105 MPa、温度125 ℃状态下保持15 min～20 min进 行灭菌。 6组织培养 6.1外植体的选取及灭菌 6.1.1外植体选取 见3.2。 6.1.2外植体灭菌 全国团体标准信息平台 T/SAASS113—2023 3外植体灭菌流程为： a)将选取的外植体叶片用流水冲洗15 min～20 min或把外植体放入盛有洗洁精液的三角瓶中， 不断摇晃清洗15 min，再用清水反复冲洗干净，洗掉泥土及叶片表面的灰尘等杂质； b)在超净台中，将清洗干净的外植体放入无菌容器中，用无菌水冲洗2次，2 min/次～3 min/次； c)在每升溶液滴加2滴～3滴“Tween-80”的洗涤剂溶液中浸泡60 s； d)转入75 %的酒精消毒30 s，无菌水冲洗2次，2 min/次～3 min/次； e)再用0.1 %升汞溶液消毒5 min～10 min，最后用无菌水冲洗4次～5次，2 min/次～3 min/次； f)将处理好的外植体放置在无菌培养皿滤纸上，剪成2 mm～4 mm的小块； g)待无菌滤纸吸干水分后，直接接入预先配制好的培养基中，进入培养室培养。 6.2培养条件 6.2.1无菌培养室 培养温度为25 ℃±1 ℃。初代愈伤培养在暗环境培养10 d～15 d，愈伤形成后见光，愈伤继代培养 光照强度2500 Lux～4000 Lux，生芽增殖培养光照强度4000 Lux～8000 Lux，生根培养前期光照强度 8000 Lux，后期12000 Lux。除自然光照外，夜间补光4 h/d。 6.3愈伤诱导初代培养 将外植体叶片接入到愈伤培养基（40 g/LMS+3.0 mg/L6-BA+1.0mg/LNAA+0.01 mg/L2.4-D）上， 遮光暗培养10 d～14 d，培养25 d～30 d导入愈伤继代培养。 6.4愈伤诱导继代培养 初代愈伤组织在超净工作台上，剪成0.3 cm～0.5 cm小块，转入培养基（40 g/LMS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA+0.01 mg/L2.4-D）中，继续培养至产生绿色芽点，培养时间25 d～30 d。 6.5芽初代增殖培养 将继代愈伤带有绿色芽点的愈伤组织，剪成0.3 cm～0.5 cm大小，接入生芽培养基（40 g/LMS+ 1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA），诱导分化出不定芽，约25 d后继续继代增殖培养。 6.6芽继代增殖培养 将初代增殖的丛生芽剪成单株，接种于芽继代培养基（40 g/LMS+1.0 mg/L6-BA+0.3 mg/LNAA） 中，培养约30 d进行生根或保种。 6.7生根培养 高度为3 cm～4 cm的组培芽，接入生根培养基上进行培养，培养20 d～30 d。 从分化培养获得的不定芽中切取生长健壮，株高长到3 cm～4 cm的组培苗，接于生根培养基 （37.5 g/L1/2MS+0.5 mg/LIBA或37.5 g/L1/2MS+0.5 mg/LNAA）上，培养15 d～20 d后,根长3 cm～ 4 cm，单株根数3条以上，可以炼苗移栽。 6.8炼苗 选择根、茎、叶俱全，株高4 cm～5 cm，叶片4片～6片，根数3条以上，根长3 cm～4 cm的组培苗， 先带瓶放置于室温为15 ℃～28 ℃、光照强度为3000 Lux～5000 Lux、空气相对湿度≥85 %的环境中培养 5 d～7 d，然后除去瓶盖继续放置2 d～3 d以进行炼苗。 6.8.1环境条件 环境温度15 ℃～28 ℃，空气相对湿度85 %。 6.8.2基质 栽培基质成分为珍珠岩+进口草炭+细砂=1：3：1，采用98 %恶霉灵和50 %氯溴异氰尿酸钠1000倍溶 液杀菌消毒，pH值为5.5～6.5。移栽容器采用50或72孔育苗穴盘，穴盘规格根据组培苗高度和根系长度 选择。将基质喷水拌匀填充到育苗穴盘。 全国团体标准信息平台 T/SAASS113—2023 46.8.3洗苗 将组培苗从培养瓶中倒出，清水洗净根部残留的培养基，用50 %的氯溴异氰尿酸那溶液沾根8 min～ 10 min。 6.8.4穴盘定植 每穴种植1株，将小苗种植在基质中，浇透定根水。当组培苗长至3片～4片真叶后，可移入假植圃 假植或直接定植。 7炼苗期管理 栽植后的组培苗置于盖有小拱棚的苗床上，并采用遮光率为70 %～80 %的遮阳网进行遮光。栽7 d～ 10 d后去除小拱棚薄膜。 7.1水分管理 7.1.1基质浇水 基质浇水宜在早晚进行，保持基质湿度在60 %。 7.1.2喷水降温保湿 白天采用微喷喷