ICS 65.020.20 B 05 黑 DB23 龙 江 省 地 方 标 准 DB23/T 2685—2020 水稻遗传性状定向突变育种技术规程 2020-09-11 发布 黑龙江省市场监督管理局 2020-10-10 实施 发 布 DB23/T 2685-2020 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009编写规则起草。 本标准由黑龙江省农业农村厅提出。 本标准由黑龙江省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所、中国科学院遗传与发育生物学研究所。 本标准主要起草人：来永才、朱祯、王锋、孟英、唐傲、张磊、张喜娟、李平、董文军、陈在杰、 刘猷红、王立志、陈丽华、姜树坤、刘凯、刘琦、姜辉、任洋、董德建。 I DB23/T 2685-2020 水稻遗传性状定向突变育种技术规程 1 范围 本标准规定了水稻遗传性状定向突变育种技术的术语和定义、基本要求、技术流程和操作步骤。 本标准适用于水稻遗传性状定向突变育种。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 17316 水稻原种生产技术操作规程 GB/T 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 遗传性状定向突变 对目的基因特定DNA片段进行突变，使遗传性状发生定向突变的操作技术。 3.2 定向突变系统 遗传性状定向突变技术主要使用的是CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统是成簇的规律间隔的短回文 重复序列/成簇的规律间隔的短回文重复序列关联蛋白系统，其广泛存在于细菌及古生菌中, 是机体长 期进化形成的 RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。 4 基本要求 4.1 设施和设备 实验室设施、设备和试验场所符合GB/T 19489中生物安全防护水平一级的要求。 4.2 操作人员 实验操作人员应通过必要的实验技术和生物安全管理规范的培训。 4.3 记录 应包括但不限于试验开始和结束的时间，材料名称、来源、编号、保存信息、目的基因序列信息、 载体结构、表型鉴定和突变后代的检测结果等。 4.4 其他 利用遗传性状定向突变技术进行水稻育种的过程应符合相应法律法规的规定。 1 DB23/T 2685-2020 5 技术流程 技术流程应符合图 1 规定： 图1 6 遗传性状定向突变育种技术流程图 操作步骤 6.1 目标基因突变位点设计 比对受体材料全基因组序列，根据目标性状基因的来源、序列和载体启动子的种类选择适合的软件 设计基因上的突变位点。 6.2 定向突变载体的构建 对基因进行突变位点预测，设计相应引物。根据遗传性状定向突变的方式和对象选择适宜的载体， 经酶切线性化、T4 连接酶进行连接、转化大肠杆菌感受态细胞和测序鉴定，构建 CRISPR/Cas9 表达载 体。 6.3 遗传工程转化 将正确连接的重组载体转化至农杆菌，利用农杆菌介导的方法转化受体水稻的愈伤组织，筛选培养 获得再生的水稻植株。 6.4 突变体的筛选和鉴定 6.4.1 筛选鉴定引物的设计 根据筛选标记、载体特异序列、目的基因序列和突变位点，利用专业软件设计检测引物。 6.4.2 突变植株的鉴定 提取突变当代水稻的基因组 DNA，利用筛选标记和载体特征引物对突变后代进行 PCR 扩增，均能扩 增出目的条带的为突变植株。 6.4.3 突变位点分析 对突变植株的基因突变位点区域进行测序，鉴定突变位点的突变类型，选择有效的突变类型单株进 行种子收获并继续种植。 2 DB23/T 2685-2020 6.4.4 突变体表型分析 从有效的定向突变体后代中选择纯合株系进行突变位点表型测定和主要农艺性状调查，田间记载项 目参考 GB/T 17316 执行，结合突变位点遗传稳定性的验证，可获得稳定的遗传性状定向突变水稻。 3