ICS 07.100.99 B 41 DB 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1850—2020 动物垫料中菌落总数检测 Detection for aerobic plate count in animal bedding 2020-02-25 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-03-25 实施 发 布 DB15/T 1850—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：赵治国、陈林军、敖威华、延涵、崔强、王海艳、于志超、刘佳、任彩霞、刘 来俊、张晓东、杨帆、陈少博。 I DB15/T 1850—2020 动物垫料中菌落总数检测 1 范围 本标准规定了动物垫料中菌落总数的平板计数法。 本标准适用于动物垫料中菌落总数的定量检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值得表示和判定 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫 物。 3.2 菌落总数 aerobic plate count 2 检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每 g（cm ）检样 中形成的需氧和兼性厌氧微生物菌落总数。 3.3 菌落形成单位 colony forming unit（CFU） 在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。 4 设备和材料 4.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 4.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 1 DB15/T 1850—2020 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 4.18 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 天平：感量为 0.1 g。 均质器。 振荡器。 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶：250 mL、500 mL。 无菌培养皿：直径 90 mm。 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 放大镜或/和菌落计数器。 无菌规格板：5 cm × 5 cm。 漩涡混合器。 无菌量筒。 无菌棉签。 无菌镊子。 无菌剪刀。 无菌滤膜均质袋。 5 培养基和试剂 5.1 5.2 5.3 5.4 实验用水：符合 GB/T 6682 的要求。 无菌生理盐水：见附录 A.2。 磷酸盐缓冲液：见附录 A.3。 平板计数琼脂培养基：见附录 A.4。 6 操作步骤 6.1 采样 6.1.1 采样原则 样品采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 6.1.2 颗粒状或粉末状样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后称取25 g颗粒状或粉末状垫 料样品，加入225 mL无菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水），充分振摇或均质1 min～2 min，制成1:10的 样品匀液。 2 DB15/T 1850—2020 6.1.3 平面样品 表1 不同面积平面类垫料样品采样量 样品面积 m 2 采样量 cm 2 规格板数 小于0.25（含） 25 1 0.25～0.5（含） 50 2 0.5～0.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 稀释无菌操作将灭菌规格板（5 cm×5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或 生理盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪 去棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL 无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小 重复采样 1～4 个规格板面积，采样量见表 1，相应地将棉拭子头置入 25 mL～100 mL 的无菌稀释液中， 充分振摇制成样品原液（1 mL 原液对应的样品面积为 1 cm2）。取 1 mL 样品原液注入含有 9 mL 无菌稀 释液的试管中，制成 1:10 的样品匀液。 6.2 稀释 6.2.1 取 1 mL 1:10 样品匀液注入含有 9 mL 无菌稀释液的试管中，另换一支 1 mL 无菌吸管反复吹吸， 或在旋涡混合器上混匀，此液为 1:100 的样品匀液。 6.2.2 按 6.2.1 操作，制备 10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 支 1 mL 无菌吸管。 6.2.3 根据对垫料样品污染状况的估计，选择 2～3 个适宜稀释度的样品匀液，在进行 10 倍递增稀释 的同时，每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液于 2 个无菌平皿内；同时分别取 1 mL 无菌稀释液加入 2 个无菌平皿作空白对照。 6.2.4 及时将 20 mL～25 mL 冷却至 46 ℃的平板计数琼脂培养基(可置于 46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保 温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。置水平台面待培养基完全凝固。 6.2.5 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层 平板计数琼脂培养基(约 4 mL)，凝固后翻转平板，再进行培养。 6.3 培养 琼脂凝固后倒置平板，置36 ℃±1 ℃培养箱中培养48 h±2 h，观察并计数结果。 6.4 菌落计数 6.4.1 用肉眼观察，必要时可用放大镜或低倍镜，记录稀释倍数和相应的菌落总数。以菌落形成单位 （colony-forming units，CFU）表示。 6.4.2 选取菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的平 板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。 6.4.3 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释 度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计数半个平板菌落数 后乘以 2，代表该平板菌落数。 6.4.4 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 3 DB15/T 1850—2020 7 结果与报告 7.1 结果 7.1.1 若只有一个稀释度的两个平板菌落数在 30 CFU～300 CFU 时，计算同一稀释度的两个平板菌落 数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数。 7.1.2 若有两个稀释度平板上菌落数均在 30 CFU～300 CFU 时，按以下公式（1）计算： N C (n1  0.1n2 )d ……………………………（1） 式中： N ——样品中菌落总数； ∑C ——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1 ——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2 ——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d ——稀释因子（第一稀释度）。 7.1.3 若所有平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其它平板可记录为多 不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 7.1.4 若所有平板上菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。 7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算，同时应选取稀释倍数较低的 平均菌落数进行计算。 7.2 报告 7.2.1 菌落数按“四舍五入”原则修约。菌落数在 10 CFU 以内时，采用一位有效数字报告；菌落数在 10 CFU～100 CFU 之间时，采用两位有效数字报告。 7.2.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后 面用 0 代替位数来表示结果；也可用 10 的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两 位有效数字。具体修约规则按照 GB/T 8170 执行。 7.2.3 若空白对照平板上有菌落出现，则此次检测结果无效。 2 7.2.4 以 CFU/g 或 CFU/cm 为单位报告菌落总数。 4 DB15/T 1850—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 生理盐水 A.2.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 mL A.2.2 制法 氯化钠加入1000 mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，分装后，121 ℃灭菌15 min，备用。 A.3 磷酸盐缓冲液 A.3.1 成分 磷酸二氢钾 34.0 g 蒸馏水 1000 mL A.3.2 制法 贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH 至7.2±0.1，用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。 稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。 A.4 平板计数琼脂培养基 A.4.1 成分 胰蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 2.5 g 葡萄糖 1.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL 5 DB15/T 1850—2020 A.4.2 制法 上述各成分加入蒸馏水中，加热溶解，调至pH至7.0±0.2。分装后，121 ℃灭菌15 min，备用。 _________________________________ 6