ICS 07.100.99 B 41 DB 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1851—2020 动物垫料中霉菌检测 Detection for mold count in animal bedding 2020-02-25 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-03-25 实施 发 布 DB15/T 1851—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古农业大学。 本标准主要起草人：赵治国、王海艳、于志超、陈林军、延涵、崔强、敖威华、盛万里、杨帆、李 军燕、罗晓平、姚利宏。 I DB15/T 1851—2020 动物垫料中霉菌检测 1 范围 本标准规定了动物垫料中霉菌平板计数检测法。 本标准适用于动物垫料中霉菌的定量检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫 物。 3.2 菌落形成单位 colony forming unit（CFU） 在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。 4 设备和材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 恒温培养箱：28 ℃±1 ℃。 均质器。 天平：感量 0.1 g，0.0001 g。 漩涡混合器。 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 高压蒸汽灭菌器。 无菌试管：18 mm×180 mm。 1 DB15/T 1851—2020 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 无菌均质杯或无菌滤膜均质袋。 无菌平皿：15 mm×90 mm。 无菌锥形瓶：500 mL。 无菌量筒。 无菌规格板：5 cm×5 cm。 无菌吸管：1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)。 无菌棉签。 无菌镊子。 无菌剪刀。 无菌勺。 5 培养基和试剂 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 实验用水：符合 GB/T 6682 的要求。 生理盐水：见附录 A.2。 磷酸盐缓冲液：见附录 A.3。 孟加拉红琼脂：见附录 A.4。 马铃薯葡萄糖琼脂：见附录 A.5。 6 操作步骤 6.1 采样 6.1.1 采样原则 样品采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 6.1.2 颗粒状或粉末状样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后称取25 g颗粒状或粉末状垫 料样品，加入225 mL无菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水），充分振摇或均质1 min～2 min，制成1：10 的样品匀液。 6.1.3 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cm×5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理盐水） 的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去棉拭子与手接 触的部分，将棉拭子头置入装有25 mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小重复采样1～4 个规格 板面积，采样量见表1，相应地将棉拭子头置入25 mL～100 mL的无菌稀释液中，充分振摇制成样品原液（1 mL 2 原液对应的样品面积为1 cm ）。取1 mL样品原液注入含有9 mL无菌稀释液的试管中，制成1：10的样品匀液。 2 DB15/T 1851—2020 表1 不同面积平面类垫料样品采样量 样品面积 m 采样量 2 cm 2 规格板数 小于0.25（含） 25 1 0.25～0.5（含） 50 2 0.5～0.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 6.2 稀释 6.2.1 取 1 mL 1:10 样品匀液注入含有 9 mL 无菌稀释液的试管中，另换一支 1 mL 无菌吸管反复吹吸， 或在旋涡混合器上混匀，此液为 1:100 的样品匀液。 6.2.2 按 5.2.1 操作，制备 10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 支 1 mL 无菌吸管。 6.2.3 根据对垫料样品污染状况的估计，选择 2～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）， 在进行 10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液于 2 个无菌平皿内。同时分别取 1 mL 无菌稀释液加入 2 个无菌平皿作空白对照。 6.2.4 及时将 20 mL～25 mL 冷却至 46 ℃±1 ℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红琼脂(可置于 46 ℃± 1 ℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。置水平台面待培养基完全凝固。 6.3 培养 将马铃薯葡萄糖琼脂平板或孟加拉红琼脂平板正置于 28 ℃±1 ℃专用培养箱中培养，从第 3 天开 始观察霉菌菌落数，并做相应标记和记录，直到第 5 d 的培养结束，最终霉菌菌落数以第 5 d 计数结果 为准。 6.4 菌落计数 用肉眼观察，必要时可用放大镜或低倍镜，记录稀释倍数和相应的霉菌菌落数，以菌落形成单位 （colony-forming units，CFU）表示。选取菌落数在 10 CFU～150 CFU 的平板计数霉菌。霉菌蔓延生 长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延。 7 结果与报告 7.1 结果 7.1.1 若只有一个稀释度的两个平板霉菌菌落数在 10 CFU～150 CFU 时，计算同一稀释度的两个平板 菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数。 7.1.2 若有两个稀释度平板上菌落数均在 10 CFU～150 CFU 时，按以下公式进行计算： N C (n1  0.1n2 )d ……………………………（1） 式中： N ——样品中霉菌数； ∑C ——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； 3 DB15/T 1851—2020 n1 ——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2 ——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d ——稀释因子（第一稀释度） 。 7.1.3 若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其它平板可记录为多 不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 7.1.4 若所有平板上菌落数均小于 10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。 7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 10 CFU～150 CFU 之间，其中一部分小于 10 CFU 或大于 150 CFU 时，则以最接近 10 CFU 或 150 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算，同时应选取稀释倍数较少的 平均菌落数进行计算。 7.2 报告 7.2.1 霉菌菌落数按“四舍五入”原则修约。霉菌菌落数在 10 CFU 以内时，采用一位有效数字报告； 霉菌菌落数在 10 CFU～100 CFU 之间时，采用两位有效数字报告。 7.2.2 霉菌菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字， 后面用 0 代替位数来表示结果；也可用 10 的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用 两位有效数字。具体修约规则按照 GB/T 8170 执行。 7.2.3 若空白对照平板上有霉菌菌落出现，则此次检测结果无效。 2 7.2.4 以 CFU/g 或 CFU/cm 为单位报告霉菌数。 4 DB15/T 1851—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 生理盐水 A.2.1 成分 氯化钠 蒸馏水 8.5 g 1000 mL A.2.2 制法 氯化钠加入1000 mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，分装后，121 ℃高压灭菌15 min，备用。 A.3 磷酸盐缓冲液 A.3.1 成分 磷酸二氢钾 蒸馏水 34.0 g 1000 mL A.3.2 制法 贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调 节pH至7.2±0.1，用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。 稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。 A.4 孟加拉红培养基 A.4.1 成分 蛋白胨 葡萄糖 磷酸二氢钾 硫酸镁（无水） 琼脂 孟加拉红 氯霉素 5.0 g 10.0 g 1.0 g 0.5 g 20 g 0.033 g 0.1 g 5 DB15/T 1851—2020 蒸馏水 1000 mL A.4.2 制法 上述各成分加入蒸馏水中，加热溶解，补足蒸馏水至1000 mL，分装后，121 ℃高压灭菌15 min， 避光保存备用。 A.5 马铃薯葡萄糖琼脂 A.5.1 成分 马铃薯浸粉 葡萄糖 琼脂 氯霉素 蒸馏水 5 g 20 g 20 g 0.1 g 1000 mL A.5.2 制法 准确称取以上成分，加1000 mL蒸馏水，加热煮沸至完全溶解，121 ℃高压灭菌15 min，备用。 _________________________________ 6